寡核苷酸药物凭借其高特异性和广泛的靶点覆盖，正在为心血管疾病、阿尔茨海默病等慢性疾病带来新的治疗希望。然而，这类药物的生产工艺中，有一个关键环节长期困扰着制药企业——氨解反应。
氨解是寡核苷酸合成后从固相载体上切割下来、并脱除碱基保护基的核心步骤。传统工艺中，这一过程几乎完全依赖离线取样检测：操作人员在不同时间点从反应体系中取样，稀释后用紫外分光光度计测定浓度。这种做法不仅操作繁琐、易引入取样误差，更关键的是存在监测延迟——当检测结果显示反应完成时，往往已过反应终点数十分钟甚至数小时，导致批间差异大、产物降解风险高、生产难以连续化。
近日，沈阳药科大学与石药集团联合发表于《Organic Process Research & Development》的研究《Real-Time Process Monitoring Ammonolysis of Oligonucleotides with Online FTIR Spectroscopy》，首次将在线衰减全反射-傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）技术引入寡核苷酸氨解过程，实现了这一关键步骤的实时、无损、精准监测。
为何是红外？
传统紫外（UV）检测在260 nm处可定量核酸，但其线性范围仅适用于0–10 mg/mL的稀溶液。而工业氨解液中，寡核苷酸浓度可达50–80 mg/mL，远超UV的检测上限。水对红外有强吸收，但ATR探针通过短光程设计（约0.5–2 μm），成功“压制”了水的干扰，使溶质的红外信号清晰可辨。
研究团队首先对寡核苷酸标准品进行了红外特征峰指认，确定了四个关键波数：
- 1232 cm⁻¹：磷酸二酯键O=P-O不对称伸缩振动
- 1457 cm⁻¹：碱基氨基-NH₂面内弯曲振动
- 1504 cm⁻¹：酰胺基-C(O)-NH-面内弯曲振动
- 1635 cm⁻¹：C=C和C=N伸缩振动
在0–200 mg/mL浓度范围内，这四个特征峰的峰高与浓度呈现良好的线性关系（R²均大于0.97），为在线定量奠定了坚实基础。
不同条件下的稳健表现
为验证该方法的普适性，研究团队设计了多种工艺条件组合：不同氨解温度（36°C vs 25°C）、不同固相载体载量（250 μmol/g vs 350 μmol/g）、不同载体类型（聚苯乙烯PS vs 可控孔玻璃CPG）、以及不同氨水投料比。
结果显示：
- 温度越高，氨解切割效率越高（36°C比25°C快约65分钟）
- 载体载量越高，切割效率越低
- 氨水投料比影响不显著
- CPG载体的切割效率远高于PS载体（仅需28分钟）
将在线红外测得的峰高-时间曲线与离线UV测得的浓度-时间曲线进行相关性分析，四个特征峰的Pearson相关系数均大于0.9，其中1232 cm⁻¹磷酸骨架峰相关性最优，在五种实验条件下均接近0.99。这说明在线红外系统在不同工艺条件下均能稳定、准确地反映氨解进程。
从实验室到工业规模
研究团队进一步模拟工业生产线，搭建了一套包含氨解罐、循环泵、红外探测器和反应柱的在线氨解系统。在装载了1895 μmol合成规模的Unylinker PS 250载体后，直接对合成柱内的寡核苷酸进行在线氨解监测。
结果令人振奋：氨解切割终点为165分钟，与实验室小试（155分钟）高度吻合，两者相关系数高达0.9968。四个红外特征峰与UV曲线的相关性再次全部大于0.9。这意味着，该系统在不同规模、不同条件下均表现出优异的稳定性和通用性。
突破性意义
这是公开文献中首次报道的寡核苷酸氨解过程在线红外监测系统。与传统离线方法相比，该技术具备三大核心优势：
- 实时监测：无需取样、稀释，直接在反应体系中获取数据，真正实现“看见”反应进程
- 精准控点：通过红外曲线斜率趋零准确判断切割终点，避免过反应导致的杂质增加
- 连续化友好：无需拆卸合成柱，直接在线氨解，为全流程自动化铺平道路
该技术的成功开发，不仅为寡核苷酸氨解过程提供了首个有效的在线控制解决方案，更将过程分析技术（PAT）引入寡核苷酸药物生产的关键环节，为工业规模化生产中的质量控制、工艺优化和连续制造奠定了坚实的技术基础。
随着寡核苷酸药物在慢病治疗领域的应用不断拓展，这类“看得见”的智能工艺控制技术，将成为保障药品质量稳定、提升生产效率、降低制造成本的关键支撑。
本文由浙江恒康药业股份有限公司负责信息整理。浙江恒康药业股份有限公司提供亚磷酰胺单体、GalNAc等关键原料及技术支持，致力于推动寡核苷酸药物的产业化进程。